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     不同的細胞，喜歡的環境是不一樣的   這個不僅僅是說培養基的不同，還有就是細胞生長的空間密度問題。有些細胞有密度依賴性，數量多一點時比較好生長，生長狀態也比較好，這種一般是屬于生長速度慢的細胞，譬如內皮細胞。而有一些是細胞是數量少一點細胞狀態會生長的比較好，譬如巨噬細胞和某些腫瘤細胞，尤其是巨噬細胞，生長速度非常得快，貼壁速度很快，所以傳代時就應該留很少量的細胞，這樣細胞狀態會比較好。并且，巨噬細胞比較喜歡扎堆生長，而堆與堆之間是有空間的，如果長成相連在一起的一滿片的時候，細胞形態基本上就會差了，老化的會比較多，對后期實驗結果不好。所以在養細胞的時候應該摸索該細胞喜歡的生長空間密度問題。

細胞形態不好或狀態差怎么辦？

      對于貼壁細胞，如果細胞形態不好，（或者細胞形態不清晰，表面似有異物等）可以在傳代的時候進行如下操作：

首先，倒掉舊的培養基，加入3ml PBS洗滌一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的 PBS進行預吹打，控制吹打力度，輕輕地大概沿著瓶底過一遍，然后吸走。這時候再開始正式的消化、吹打。

      其次，把吹打下來的細胞懸液加入到新的培養瓶內，培養瓶事先加入培養基，放入培養箱內培養，按時間點觀察細胞貼壁情況。10分鐘觀察一次，20分鐘，30分鐘觀察一次。選擇一個時間點，已經有部分細胞貼壁的情況下，重新置于潔凈臺，底面朝上迅速倒出其中的培養基，加入3ml新培養基再輕輕洗一次。然后，加入完全培養基培養。后續觀察細胞生長情況以及形態，如果一次效果還不理想，可重復多次。直到找到細胞完美形態。其中要注意結合細胞喜歡的生長情況,對于有密度依賴性的細胞，等貼壁細胞比較多點的時候再傳傳代，反之亦然。對于懸浮細胞，如果細胞培養過程中有較多死細胞或細胞碎片，可將細胞吹散后用離心管收集離心，離心后沉淀分為兩層，活細胞處于上層，死細胞和細胞碎片處于下層，呈白色。去上清，加入新鮮培養基將上層細胞輕輕吹打混勻（不要用力過猛，從而將細胞碎片吹散），再將細胞懸液接種至新的培養瓶，放入培養箱繼續培養。

       細胞傳代消化的問題 可以這樣說，對于需要消化傳代的細胞，每一次消化都是對這個細胞存活與否、狀態好與不好的至關重要的考驗。我們經常會遇到這樣的問題，自己培養的細胞開始幾代生長狀態良好，可是傳代幾次之后細胞狀態就不行了，越來越差。對于這個問題，可以非?？隙ǖ卣f，細胞消化環節出問題了，每一次消化都讓細胞受到較大損傷，所以越長越差。

在消化的過程中，加入胰酶后，所有細胞都在被胰酶消化著，但是每個細胞的生長狀態是不一樣的，細胞的貼壁情況也是不一樣的，有的貼壁牢固，有的貼壁較松，這一點往往容易被忽視。對于較難消化或對胰酶敏感的細胞，可以采用四步消化法，具體操作如下：

第一步：不加胰酶，倒掉舊培養基加入少量新培養基洗1-2遍，（這是前奏，目的是將漂浮著的死細胞之類盡量洗掉。

第二步：加入少量新培養基直接吹打一遍，把貼壁不牢固的細胞吹打下來，再用培養基清洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶。（可以將這些傳入新瓶培養，與后面胰酶消化過的細胞生長狀態進行對比觀察即可知道該細胞對胰酶的敏感度。）

第三步：吸干凈瓶內剩余液體，加入2mlPBS潤洗一遍，吸掉棄之，再加入1ml左右的胰酶消化。消化的同時置于顯微鏡下觀察，待細胞與細胞之間間隙明顯的時候立即吸掉胰酶于干凈EP管備用，加入新培養基吹打2-3遍后吸取懸液于離心管或新瓶暫存。用2ml左右新培養基洗一遍與前面的混合（也可以傳入新瓶培養，以便與后面及前面的做對比）。

第四步：把第三步吸出來的胰酶重新加入瓶內，繼續消化剩余的貼壁牢固的細胞（也可以用新的胰酶），繼續鏡下觀察，待剩余細胞間隙明顯，細胞獨立開來的時候，吸掉胰酶，加入新培養基吹打，懸液傳入新瓶培養。

將細胞消化分成這幾步，除了是為了避免胰酶對細胞的損傷之外，還有一個更重要的作用就是，可以最大程度地把細胞吹打成單個單個的狀態，不成片不連體。