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雙熒光素酶測定法,用于檢測基因調控、信號通路和藥物篩選等方面的研究。該方法通過測定熒光素酶的熒光強度,反映了基因的表達水平或信號通路的活性。
以下是雙熒光素酶報告測定法的一般步驟:
1.構建表達雙熒光素酶的質粒:在質粒中克隆想要研究的基因的啟動子區域(或者其他感興趣的區域),并將雙熒光素酶基因放在該啟動子區域下游,形成表達雙熒光素酶的質粒。
2.轉染質粒:將構建好的質粒轉染到目標細胞中,使其表達雙熒光素酶。
3.處理樣本:根據實驗的需要,處理細胞樣本,如添加藥物、激素等。
4.添加底物:將Luciferin底物加入到樣本中,Luciferin是一種可以被熒光素酶催化分解的化合物,分解后會放出熒光。
5.測定熒光:使用熒光儀測定Luciferin分解后放出的熒光強度,該熒光強度反映了雙熒光素酶的活性。同時,也可以在熒光素酶的另一端接入Renilla熒光素酶,用來進行內部對照,來排除細胞數量和轉染效率的影響。
6.計算結果:根據實驗的需要,計算樣本中Luciferin分解的熒光強度,比較各樣本之間的差異,來推斷基因表達水平或信號通路活性等。